Манассеин занимал должность прокурора Московской судебной палаты более семи лет. В декабре 1877 года он был назначен директором департамента Министерства юстиции, сменив на этом посту А. Ф. Кони, а в сентябре 1880 года ему было повелено присутствовать в Правительствующем сенате. Наиболее впечатляющий след на этом поприще оставила его «стремительная и разрушительная», по выражению А. Ф. Кони, ревизия Лифляндской и Курляндской губерний. Проверка продолжалась 15 месяцев и потребовала от Николая Авксентьевича огромного напряжения всех духовных и физических сил. Вскоре после ее окончания он тяжело заболел. В письме от 14 января 1884 года он писал своему другу: «Мое молчание объясняется долгою и серьезною болезнью; теперь хотя и поправляюсь, но медленно. Я едва не отправился на тот свет (было такое опасение 3–4 дня); началось с конца ноября с брюшного тифа, но я, не зная, что со мною делается, думал, что меня так себе ломает и лечил себя сам большими приемами хины, за то, потом, свалился как пласт… Спасибо докторам (мой брат с Генрихсен), занялись мною преусердно, и вот теперь, спустя месяц, поставили меня на путь, по-видимому, благополучного выздоровления, за исключением только головы, которая пока никуда не годится, и потому никакая умственная работа для меня невозможна; при этом доктор строжайше требует, чтобы я, по крайней мере, месяц еще ничего не делал. Чувствую, что он прав, а между тем именно теперь-то мне до зарезу нужно приниматься за серьезную работу, потому что болезнь задержала мой Всеподданнейший рапорт и все другие исполнительные труды для разных министерств (по ревизии)».

В 1884 году Н. А. Манассеин представил императору Александру III Всеподданнейший доклад о результатах ревизии в Прибалтийском крае, который был полностью одобрен, а также массу записок, предназначенных для различных ведомств. Этот труд послужил основанием для осуществления в Прибалтике целого ряда реформ.

В ноябре 1885 года Николай Авксентьевич был назначен министром юстиции и генерал-прокурором. Этот пост он занимал более восьми лет, многое сделав для укрепления судебных и прокурорских органов. Его деятельность пришлась на трудные годы, когда после убийства Александра II и усиления революционной борьбы Судебные уставы стали явно мешать правительству. А. Ф. Кони писал, что судебному ведомству приходилось «переживать на себе взгляды, исполненные недоверия и отчуждения». Поэтому не случайно деятельность Манассеина на посту министра вызывала много нареканий, причем с совершенно противоположных сторон. Одни считали его слишком либеральным, другие же, наоборот, — чересчур консервативным. Однако сам Николай Авксентьевич работал в присущей ему манере — страстно, энергично, и в то же время кропотливо, въедливо. Первостепенной задачей его в первые годы руководства Министерством юстиции стало распространение Судебных уставов на Прибалтийские губернии. В течение двух лет, на основании материалов ревизии, разрабатывалась специальная программа преобразования этого края. В декабре 1887 года соответствующий проект был одобрен Государственным советом, а затем утвержден императором.

При Манассеине частичные судебные преобразования коснулись также Туркестанского края, Степных областей России и Архангельской губернии. Здесь был введен институт мировых судей, с нескольким расширением их компетенции при рассмотрении уголовных и гражданских дел и возложением на них функций судебных следователей.

Продолжался пересмотр и самих Судебных уставов. Значительно сузилась категория дел, подлежащих рассмотрению судом присяжных. Манассеин считал, что присяжные, принадлежащие большей частью к мещанской и крестьянской среде, лучше всего справляются с простейшими делами. Что же касается сложных дел, требовавших углубленного анализа доказательств, проведения многочисленных экспертиз, то в них они испытывали серьезные затруднения. Поэтому он предложил устранить присяжных заседателей от рассмотрения всех дел о сопротивлении властям, о насильственных посягательствах на представителей власти, о преступлениях по службе и т. п. В 1889 году проект Н. А. Манассеина удостоился высочайшего утверждения, с поправкой на то, что изъятые из ведения присяжных заседателей дела подлежат рассмотрению не особыми присутствиями окружных судов, а судебными палатами с участием сословных представителей. Манассеин предложил также ограничить число дел, подлежащих публичному рассмотрению.

Современники отмечали, что Н. А. Манассеин постом министра юстиции дорожил, но не как атрибутом власти, а как знаком высочайшего к нему доверия монарха. Поэтому в делах управления вверенного ему министерства, «имея в помышлении интересы одного лишь государя», был довольно решителен. Свое высокое положение министра и генерал-прокурора он понимал, как положение «старшего между равными». Однако к вопросам соблюдения служебной дисциплины относился строго и требовательно.

Будучи человеком прямым, Манассеин любил, чтобы и ему говорили все начистоту; он легко распознавал малейшее лукавство. К мнению других лиц, юристов-профессионалов, как правило, прислушивался, хотя, с другой стороны, был не лишен самолюбия и не терпел, когда ему подсказывали то, что он сам лучше других знал.

Н. А. Манассеин и в звании министра оставался непримиримым врагом подхалимажа и «прихвостничества», холоден был к заискиванию и проявлениям раболепства. Он не любил, чтобы чиновники судебного ведомства встречали его на станциях во время поездок по России. В сотрудниках он ценил прежде всего ум, энергию, способность к самопожертвованию. С приезжающими в Петербург по делам судьями и прокурорами встречался всегда приветливо, часами беседовал с ними. Доступ просителей к нему был свободен. Однако по служебным делам он не любил ходатайств «сторонних лиц», в особенности посредничества «дам высшего общества».

При Н. А. Манассеине было проведено не столь много политических процессов, всего 37. Наиболее важный из них, покушение на государя, получивший название «Второе 1-е марта», происходил 15–19 апреля 1887 года. Дело слушалось при закрытых дверях. В зал допускались только члены Государственного совета, министры, их товарищи, Сенаторы и другая избранная публика. Все 15 подсудимых были приговорены к смертной казни; в отношении 8 человек о смягчении наказания ходатайствовало даже Особое присутствие. Александр III утвердил смертную казнь для 5 подсудимых: А. И. Ульянова, П. И. Андреюшкина, В. Д. Генералова, В. С. Осипанова и П. Я. Шевырева. Они были казнены 8 мая 1887 года в Шлиссельбургской крепости.

В начале 1890-х годов «служебная прочность» Манассеина несколько поколебалась. Все чаще и откровеннее государь выражал ему свое неблаговоление. В ноябре 1893 года вконец измученный Манассеин писал своему другу: «Изнемог я донельзя и телом и еще более духом; — мои несчастные, давно расшатанные нервы стали совсем никуда не годными. Еще в сентябре я доложил государю, что по совершенному расстройству моего здоровья у меня нет более сил нести лежащих на мне обязанностей, но тогда никакого ответа не получил, а потому теперь решился, какие бы тяжелые последствия ни произошли для меня от этой решимости, — отнюдь не оставаться в министерстве долее наступающего нового года…» И далее: «Я, право, боюсь, что меня от непрерывного ежечасного волнения того и гляди хватит нервный удар… Жизнь наша, конечно, в руке Божьей, но когда на руках больная, без движения, жена да сынишка, которого еще надо поставить на ноги, то непозволительно самому укорачивать свою жизнь и себя убивать…»

1 января 1894 года Н. А. Манассеин был отправлен в отставку и покинул пост министра юстиции и генерал-прокурора. Его назначили членом Государственного совета. Однако из-за болезни он не смог долго выполнять свои новые функции.

16 сентября 1895 года Н. А. Манассеин скончался. На его похоронах присутствовали молодой император Николай II и члены царской фамилии.

Брат Н. А. Манассеина, Вячеслав Авксентьевич, был знаменитым врачом, профессором, начальником Военно-медицинской академии.