В 1556 году казацкий предводитель Дмитрий Вишневецкий заложил на острове Хортица в низовьях Днепра земляной «город». Он стал главной базой дальнейших операций запорожских казаков. Именно отсюда они направлялись вниз по реке для захвата турецкой крепости Ислам-Кермен. Захваченные там пушки были установлены на новых укреплениях. Крымский хан два раза ходил в походы против казаков, стремясь их выбить с острова, но только второй закончился удачно. Казаки, сидя в осаде, съели всех лошадей и прочую живность и только после этого покинули Сечь.

Впрочем, польские власти не слишком доверяли запорожским казакам, поскольку они продолжали поддерживать отношения с пограничным русским населением, а через них и с московскими властями. Поэтому неудивительно, что часть казаков, после смерти Дашковича, перешла в подданство Москвы. Инициатором перехода стал Дмитрий Вишневецкий, который отправил атамана Есковича с 300 казаками в Москву с предложением своих услуг Ивану IV.

Казаки были слишком хорошими воинами, чтобы от их услуг можно было легко отказаться. Поэтому в 1576 году при гетмане Богдане король Стефан Баторий пожаловал казакам хоругвь, бунчук, булавы, герб и выбрал из числа казаков старшин. Шесть тысяч казаков были занесены в специальные реестры, получая плату за воинскую службу. Однако количество желающих существенно превышало выделенные квоты, поэтому те, кто не попадал в реестр, устремлялись в низовья Днепра, за пороги, где занимались грабежом на границе. Так началось разделение казачества на реестровое и низовое, или вольное. Каждая из этих категорий казаков выбирала себе предводителя — гетмана, который должен был возглавлять их в военных походах и представлять во время дипломатических переговоров.

После смерти Стефана Батория в 1586 году и восшествия на престол Сигизмунда III запорожцы еще больше усиливают нажим на турецкие владения. В это время запорожское войско начинает быстро увеличиваться за счет населения центральных районов Украины. Это явление носило столь массовый характер, что польские власти были вынуждены в 1589 году издать универсал, запрещающий украинцам переселяться в низовья Днепра. Уличенного в грабежах местные власти должны были передавать суду для последующей публичной казни. Для выполнения этого закона были выделены особые чиновники, которые должны были следить за передвижениями в приграничье и доносить коронному гетману о действиях запорожцев. Как показала дельнейшая история, эти меры оказались крайне неэффективными.

В 1590 году Сигизмунд издает новый указ, согласно которому украинские гетманы должны были утверждаться лично королем. Кроме того, он ограничил число реестровых казаков до 6000 человек. Они не имели право совершать самовольные военные походы и заключать соглашения от своего имени. Для надзора за соблюдением этих условий король назначал своих чиновников. В последующие времена эти постановления будут неоднократно повторяться, но запорожцы их игнорировали.

В то же время, когда формировалось запорожское казачье войско, происходило формирование и донского. На южное пограничье Руси стекались толпы бедняков, которые стремились найти здесь вольное житье. Многие из них были преступниками, которые желали поживиться за счет богатых караванов, направлявшихся вниз по Волге и Дону. Сложно точно определить, когда появились первые казачьи поселения в низовьях Дона, однако изначально «вольница» собиралась в городке Раздоры, в 120 верстах от турецкой крепости Азов, на месте соединения Северского Донца с Доном. Казаки предпочитали селиться в укромных местах, в лесу или за болотом, на острове или между густыми камышами. На выбранном месте ставили частокол или плетень. Особых укреплений изначально не строили, жили в шалашах и полуземлянках. Поскольку жизнь была достаточно бедной, поселения казаков мало привлекали врагов.

Уже в 1496 году в грамоте рязанского князя Федора Васильевича к великому князю московскому Ивану III сообщается о том, что низовья Дона заселили казаки, которые занимались охотой, рыбной ловлей, сбором меда, воска и различными промыслами. Общность интересов и промыслов, схожие условия жизни, единая религия и этническая близость сделали казаков Днепра и Дона естественными союзниками в борьбе с главным врагом того времени — татарами. В 1515 году донские и днепровские казаки совершили первый совместный поход в Крым. Разгромив вражеские улусы, они с добычей вернулись обратно. Этот первый успех стал предвестником многочисленных совместных походов последующих столетий против турецко-татарских захватчиков.

Отряд запорожских казаков, пришедших на Дон, основал недалеко от Азова передовую крепость Черкасский городок, ставшую впоследствии городом Черкасском. Разгульный образ жизни, который вели запорожцы, был очень привлекателен для донской молодежи, поэтому с течением времени население Черкасского городка все более и более увеличивалось. Сюда стали стекаться не только русские и украинские казаки, но и татары, ногайцы, греки и представители других народов.

Когда количество вольных людей увечилось настолько, что они стали составлять внушительную силу, образовалось Донское казачье войско. Землю казаки не пахали, поэтому промышляли кто чем мог. Одни сторожили торговые суда на Волге, другие грабили пограничные русские селения, третьи совершали налеты на ногайские и татарские табуны. Ввиду схожести образа жизни донские казаки быстро наладили связи со своими днепровскими коллегами. Отряды запорожских казаков, или, как их называли тогда, черкасов, были обычными гостями на Дону. Совместно они совершали набеги на крымское побережье и турецкие берега. Как и запорожцы, которые стали защитниками порубежных земель Речи Посполитои, донцы стали выполнять ту же функцию для Русского государства. Постепенно казаки спускались все ниже и ниже по течению Дона, Европейский путешественник второй половины XVII века Э. Кемпфер так описал казаков: «Казаки, которые чинили беспорядки в Шелковых странах на Каспийском море, были подданными России, населяли территорию в районе Дона, были христианами по религии, говорили и писали на русском языке…»

Несмотря на то, что добыча была главным стимулом, привлекавшим людей в эти глухие места, казаки остерегались грабить русские земли и купеческие караваны. Это могло навлечь на них царский гнев и опалу, что грозило прекращением выплаты жалованья. Донцам хватало того, что они получали в ходе набегов на кочевников и турок и персов.

Начиная со времен Ивана IV Грозного московские правители стали привлекать казаков на свою службу, обещая им богатые подарки и высокое жалованье. Каждый год донские казаки зимой отправляли посольство в Москву для получения жалованья. За верную службу царь награждал казаков деньгами и хлебом, выделал им оружие, свинец, порох и сукно. Все это на подводах доставлялось в Воронеж, где перегружалось на заранее заготовленные царские струги. Далее казаки шли вниз по Дону водным путем, пока не достигали Черкасска. Приезд каравана был настоящим событием, его встречали не менее пышно, чем возвращавшихся из военного похода. На войсковом круге распределялось денежное и вещевое жалованье.

В этих условиях положение казаков на Днепре, Дону, Волге и Яике было неоднозначным. Находясь в пограничной полосе Русского государства, они, прежде всего, выполняли функции защиты со стороны Дикого поля и были основной ударной силой на юге, однако в Поволжье, ввиду отсутствия мощного противника, характер действий казаков наносил значительно больший ущерб экономике и внешнеполитическим отношениям государства. Здесь скопилось слишком большое число «воровских людей» которые угрожали не только торговле, но и всей структуре государственной власти, что было наглядно продемонстрировано во время восстания Степана Разина.

Отношения донского казачества с московскими властями так же были противоречивыми. С одной стороны, казаки выполняли военные функции, защищая границы государства от татарских нашествий, за что получали жалованье, главным образом в виде хлеба, боеприпасов и конечно денег. С другой стороны, они были слишком беспокойным народом: постоянно совершали набеги на пограничные турецкие и татарские владения, принимали у себя беглых крестьян.