Доказательство такой точки зрения опирается на результаты многочисленных наблюдений. Вот основные. Периодичность, сохраняющаяся в постоянной темноте и при постоянной температуре, может быть нарушена прекращением доступа необходимого организму кислорода, то есть переводом его тканей в состояние аноксии, а также охлаждением организма до температуры, при которой приостанавливается его обмен. Когда же подача кислорода возобновляется или температура повышается до уровня, необходимого для нормального течения обмена, ритмическая активность восстанавливается. Энергия, необходимая для поддержания этих колебаний, вырабатывается в процессе обмена веществ. Ритм возобновляется с того самого момента, когда он был остановлен. Этот факт очень важен, поскольку он свидетельствует о независимости фазы ритма в постоянной темноте от местного времени, то есть от вращения Земли. Значит она должна быть независимой от всех факторов, связанных с вращением Земли (включая и фактор X).
Наибольшее впечатление производит тот факт, что период ритмической активности, сохраняющийся в темноте, отличается от периода вращения Земли. Сторонники эндогенной природы ритмов считают, что, только допустив очень громоздкие и маловероятные предположения, можно объяснить, например, происхождение периода длительностью в 23 часа 15 минут влиянием неизвестного внешнего фактора с периодом точно 24 часа.
Для колебаний, открытых де Мэраном, Халберг ввел термин «циркадный» (околосуточный). Этот термин подчеркивает различие в длительности периода колебаний и периода вращения Земли. Кроме того, он исключает двусмысленность, имеющуюся в термине «дневной» (в одних случаях им обозначают дневное время суток, в других — используют его в значении «суточный»). Период циркадного ритма лишь приблизительно равен периоду вращения Земли вокруг своей оси.
Организмы, принадлежащие к одному и тому же виду, генетически различаются между собой по длительности периодов свободнотекущих ритмов — периодов, которые они обнаруживают в условиях, исключающих влияние изменений светового цикла окружающей среды.
Было бы несправедливо объединять профессора Брауна с ранними исследователями фактора X, поскольку он не считает, что этим фактором можно полностью объяснить феномен де Мэрана. Браун не отрицает возможность существования периодичности и внутреннего происхождения. Его интерес к фактору X определяется потенциальной ролью последнего, как своего рода регулятора ритма, который обеспечивает точность внутренним колебаниям и компенсирует изменения температуры.
Всеобщность и распространенность циркадных ритмов
Феномен де Мэрана наблюдали у очень большого числа самых разных организмов: одиночных клеток, растений и животных, включая человека. Этот феномен является общей характеристикой физиологической организации живых существ на нашей планете. У одноклеточной светящейся водоросли Gonyaulax Гастингс и Суини обнаружили циркадные колебания фотосинтеза и клеточного деления. У мышей и крыс наблюдаются ритмические изменения фактически всех изучавшихся параметров: химического состава крови, деления клеток, температуры тела, чувствительности к рентгеновским лучам и наркотикам и т. д.
Практическое значение недавних открытий в этой области очень велико. Определенная доза токсического вещества, выделенного из кишечной палочки человека, убивает 85 % мышей при введении его в одной фазе их циркадного цикла и только 5 % — в другой. Аналогичный эффект был обнаружен Халбергом для действия сердечного стимулятора строфантина. Фаза циркадного цикла организма — очень важный параметр, которым физиолог не может и не должен пренебрегать. Тем более фармаколог!
Как сообщает Питтеидрай, поведение дрозофил и их устойчивость к изменению температуры различны на разных фазах циркадного ритма. Кроме того, выявлены заметные изменения в удельной активности ферментов при испытании любой ферментной системы in vitro (в искусственных условиях), если она изъята из организма не днем, как обычно, а глубокой ночью. Наблюдаются различия в скорости реакции между ферментом и субстратом (веществом, с которым он реагирует).
Точность, врожденных и температурная независимость циркадных ритмов
Циркадные ритмы удобнее всего изучать, регистрируя ту или иную особенность поведения организма в целом. Так, при работе с млекопитающими очень удобно наблюдать за их двигательной активностью. Грызуны, например, любят бегать во вращающихся клетках. Время начала активности и ее продолжительность легко регистрируются, если соединить вращающуюся клетку с микровыключателем и самописцем. Как только клетка начинает вращаться, перо самописца вычерчивает линию, длина которой пропорциональна времени активности (рис. 54). Начало активности при 24-часовом цикле чередования света и темноты соблюдается точно. Ночные животные начинают свою активность где-то около «заката». Если такой организм поместить в условия постоянной темноты и постоянной температуры, период активности сохраняется с удивительным постоянством и неограниченно долго. Интервал, отделяющий начало одной активности от другой, и есть период циркадного ритма.
Наиболее поразительная особенность циркадных ритмов — это сохранение их точности и постоянства в течение неограниченно долгого времени. Стандартная ошибка в длительности периода для свободнотекущих ритмов некоторых грызунов может составлять не более одной минуты. Другими словами «ошибка» составляет величину порядка 0,001.
Более того, эта ритмичность является врожденной. Она не заучивается на основании индивидуального опыта. Врожденность ритмов была показана на одноклеточных организмах, на насекомых и позвоночных.
Возможно, наиболее удивительным свойством циркадных ритмов является тот факт, что на их периоде почти совсем не сказываются даже значительные изменения температуры. Эта температурная независимость ритмов по праву представляет собой отдельную большую проблему. Трудность простого физиологического объяснения этого явления определила, по крайней мере отчасти, возобновление интереса Брауна к возможному существованию и влиянию на организмы внешнего регулятора ритмики (фактора X).
Рис. 54. Циркадные ритмы двигательной активности оленьей мыши. Цикл чередования света и темноты (СТ 1: 23) выдерживался 59 дней. К шестому дню ритм был затянут этим циклом. Начиная с 60 по 92 день вводятся условия постоянной темноты и ритм опять становится свободнотекущим. С 93 по 132 день мышь выдерживают в условиях СТ 18: 6, затем опять в условиях постоянной темноты. Обратите внимание на удивительную точность периода свободнотекущего ритма.
Клеточная основа циркадных ритмов.
За последние десять лет был установлен очень важный факт — циркадные ритмы существуют на всех уровнях организации. По данным Соннборн и Барнетт, представители Paramecium multimicronucleatum могут с правильной периодичностью переходить от одного типа размножения к другому в течение суток.
Некоторые ученые пытались найти ритмы на уровнях организации ниже клеточной. В частности, пытались выяснить, является ли ядро клетки или другая ее часть (например, цитоплазма) тем местом, где возникает ведущий ритм.
Суини и Хэксо, а также Рихтер выполнили несколько замечательных работ с водорослью Acetabularia, которая представляет собой очень удачный объект для подобных экспериментов. Дело в том, что у этого одноклеточного организма можно удалить отдельные части, и он не погибает. Исследователи, удалив при помощи очень тонкой хирургической операции ядро клетки, пытались выяснить, способна ли одна протоплазма поддерживать циркадный ритм — в данном случае ритм фотосинтеза. Оказывается, способна, и даже в течение целых тридцати циклов.
Швейгер с сотрудниками, пересадив ядро из одной клетки в другую, изготовили «синтетическую клетку», у которой ритм ядра и цитоплазмы расходились по фазе на 12 часов. При этом они обнаружили, что ритм клетки определяется ядром.