Поликарпов придавал большое значение дальнейшему совершенствованию своих самолетов. В одной из статей он писал: "Каждый из нас, конструкторов, стремится к тому, чтобы его машина как можно дольше оставалась морально молодой. Но это случается лишь с теми конструкциями, которые можно все время путем модификаций держать на уровне современной мировой техники. По сути дела модификация — продолжение конструирования, только в форме, более выгодной промышленности".

Ярким воплощением этой концепции является И-16, развитие которого шло по следующим направлениям: повышение летных и эксплуатационных качеств; повышение огневой мощи; разработка учебно-тренировочных вариантов; создание опытных и экспериментальных машин для отработки прогрессивных конструкторских идей, проверки новых двигателей, турбокомпрессоров, перспективных образцов вооружения.

Одной из наиболее массовых модификаций И-16 был тип 5. Запущенный в серию в 1935 г., он являлся развитием опытного И-16 с РЦФ-3. Его вооружение состояло из двух пулеметов ШКАС в центроплане, а максимальная скорость достигала 454 км/ч. Кабина летчика полностью закрывалась легко сдвигаемым вперед фонарем. Однако, несмотря на надежность конструкции, пилоты продолжали летать с открытыми фонарями.

В 1936 г. построена пушечная модификация- типа 5 — тип 12. В его крыле, кроме пулеметов, установили две пушки ШВАК калибра 20 мм. Параллельно на базе И-16 с мотором М-22 создали учебно-тренировочный самолет УТИ-2. В том же году КБ Поликарпова было переведено на завод № 84 в Химках. В дальнейшем подобные переезды повторялись неоднократно и стали для Николая Николаевича серьезнейшей проблемой.

В 1937 г. появился И-16 тип 6. Учитывая пожелания летчиков, конструкторы выполнили кабину открытой с козырьком, сохранившимся на всех последующих модификациях. Тип 6 оснастили двигателем М-25А (730 л. с), летные данные и вооружение соответствовали типу 5.

В этом же году был построен И-16 тип 10 с двигателем М-25В (750 л. с). Самолет имел усиленную конструкцию и посадочные щитки, впервые примененные на серийных истребителях СССР. В дополнение к двум крыльевым пулеметам над мотором появились еще два синхронных ШКАСа. Взлетный вес возрос на 200 кг. Скорость снизилась до 438 км/ч. Для этой модификации впервые в мировой практике были спроектированы убирающиеся лыжи. Тип 10 послужил основой для разработки учебно-тренировочного истребителя УТИ-4 (И-16 тип 15).

Одновременно шли работы по установке на И-16 двигателей М-62 и М-63, представлявших собой более мощные варианты М-25 с двухскоростными нагнетателями.

В начале 1938 г. КБ Поликарпова переводят на завод № 156, где ранее работал арестованный в ноябре 1937 г. А.Н. Туполев. К этому времени относится создание пушечной модификации типа 10 — тип 17, на котором заменили крыльевые пулеметы на две пушки ШВАК. Дополнительно предусматривалась подвеска до 200 кг бомб. Взлетный вес возрос до 1810 кг. Скорость снизилась до 425 км/ч, ухудшилась маневренность. Самолет предполагалось использовать против бомбардировщиков.

Летом в Горьком начались испытания И-16 тип 18 с мотором М-62 (830/900 л.с.) и винтом изменяемого шага (первоначально ВИШ-6А, затем АВ-1). Вооружение соответствовало типу 10. Благодаря более тяжелому двигателю улучшилась продольная устойчивость (центровка 27,2 % САХ). Скорость возросла до 461 км/ч, улучшилась скороподъемность.

В том же году появился И-16 тип 24. Самолет имел мотор М-63 взлетной мощностью 1100 л.с. (номинальная — 930 л. с). На нем усилили конструкцию крыла, предусмотрели установку радиостанции РСИ-3, фотокинопулемета, подвесных баков. Максимальная скорость на высоте 4800 м достигла 489 км/ч. Нормальный взлетный вес составил 1780 кг, максимальный- 2052 кг. Типы 18 и 24 имели пушечные модификации, которые получили обозначения тип 27 и 28 (аналогично типам 10 и 17).

В 1940 г. выпущена последняя серийная модификация И-16 тип 29 с мотором М-63 и винтом АВ-1. В отличие от типа 24 его маслорадиатор установили снизу капота с правой стороны между 4 и 5 цилиндрами. Шасси укоротили на 32 мм, что позволило разместить под двигателем пулемет БС (12,7 мм) в дополнение к синхронным ШКАСам. Вооружение в крыле было снято. Под плоскостями так же, как и на некоторых сериях типа 24, предусматривалась установка шести реактивных снарядов РС-82. Расчетная скорость на высоте 4500 м равнялась 510 км/ч, но фактически она была близка к типу 24. Нормальный взлетный вес составлял 1900 кг, максимальный — 2140 кг.

Первое боевое крещение И-16 получил в 1936 г. в небе Испании. Всего туда было отправлено 455 истребителей типов 5 и 10, УТИ-4. Кроме того, на республиканских заводах до 1 января 1939 г. выпустили 7 И-16 и 2 УТИ-4.

В воздушных боях И-16 имел полное превосходство над истребителями путчистов “Хейнкель-51” и "Фиат CR-32". Один из летчиков легиона "Кондор" вспоминал: "Мы вдруг поняли всю серьезность положения. Наши старые “Хейнкели-51” были слишком медлительны по сравнению с этими новыми "крысами".(4) Это казалось невероятным, но они поднимались выше нас и могли игоать с нами как им захочется"

В феврале 1937 г. в Испании появились первые серийные "Мессершмитты" Bf-109В-1, а несколько позднее — Bf-109В-2 и Bf-109С. Схватки с ними показали, что при почти равном вооружении эти самолеты не превосходят И-16 в скорости, уступают ему в скороподъемности, но имеют преимущество на виражах. Bf-109 выполняли установившийся вираж при отклоненных закрылках на скорости 170–180 км/ч, а И-16 — на 220–240 км/ч, и радиус виража у него получался больше. В целом по сумме боевых качеств эти машины были близки. Но весной 1938 г. началось производство Bf-109D-1, а в начале 1939 г. — Bf-109E-1, оснащенных значительно более мощными двигателями и вооруженных, кроме пулеметов, одной — двумя 20 мм пушками. Скорость этих машин доходила до 540 км/ч, и бороться с ними на И-16 стало очень трудно.

Осенью 1937 г. в Китае И-16 встретились в воздушных боях с японскими истребителями-монопланами А5М (И-96), а в 1939 г. на-Халхин-Голе — с Ки-27 (И-97). Эти машины, в которых конструкторы стремились совместить качества скоростного и маневренного истребителей, имели неубирающееся шасси, малую удельную нагрузку на крыло, высокую маневренность, были просты в технике пилотирования. И-16 превосходил И-97 по боевой живучести, обладал более прочной конструкцией, лучшими пикирующими свойствами, до высоты 5 км имел превосходство в скорости и скороподъемности, но уступал в маневренности. В целом японские самолеты оказались серьезными противниками.

К 1941 г, И-16 окончательно устарел, но именно ему пришлось вынести основную тяжесть воздушных боев начального периода Великой Отечественной войны. Хорошо освоенные летным и техническим составом, И-16, особенно с пушечным вооружением, в опытных руках были достаточно грозным оружием. Именно на них многие известные летчики одержали свои первые победы. На этих машинах воевал и истребительный авиаполк, ставший первым Гвардейским. По статистике командования ВВС, летом 1942 г. чисто боевые потери на один самолето-вылет на И-16 были даже несколько ниже, чем на Як-1. Но ввиду изношенности матчасти на И-16 было много потерь во внебоевой обстановке. Поэтому в порядке возрастания потерь самолеты располагались так: Як-1, И-16, МиГ-3, И-153, ЛаГГ-3 и т. д.

О боевом применении "ишаков", которые состояли на вооружении вплоть до 1943 г., рассказывают многие книги и статьи, Редко какое историческое исследование, посвященное Великой Отечественной войне и ей предшествующим конфликтам, обошлось без хотя бы упоминания об этом знаменитом истребителе.