Равным образом не мог патриарх Иов не быть преданным и новому государю - Борису Федоровичу Годунову, о котором потом в своем духовном завещании так отозвался: "Зело всячески мя преупокои во вся дни живота моего, егда бех на Коломенской епископии и на Ростовской архиепископии, такоже и в митрополитех, и на патриаршеском степени, яко не могу по достоянию изрещи превеликия его царския милости к себе, смиренному". Известно, что Иов преимущественно и содействовал избранию Годунова на царство. Когда Ирина отказалась от престола и, удалившись в Новодевичий монастырь, приняла там монашество с именем Александры, патриарх с духовенством, боярами и гражданами Москвы отправился в тот монастырь и умолял царицу благословить на царство брата своего Бориса, который и при жизни ее мужа был правителем России, а самого Бориса просил принять царское достоинство. Но Борис решительно сказал: "Мне и на ум никогда не приходило о царстве, как мне помыслить на такую высоту?.. О государстве и о всяких земских делах радеть и помышлять тебе, государю моему отцу, святейшему Иову патриарху, и с тобою боярам…" Борису хотелось быть избранным не одною Москвою, а всею Русскою землею. Созван был великий земский Собор из выборных представителей всего государства числом до 474 человек. Патриарх обратился к ним с речью (17 февраля 1598 г.) и, объявив, что по смерти царя Федора Ивановича ни царица Ирина, ни брат ее Борис, несмотря на все просьбы, не согласились занять царский престол, предложил: "Теперь вы бы о том великом деле нам и всему освященному Собору мысль свою объявили и совет дали, кому у нас государем быть?" Но вдруг же, не дожидаясь ответа, продолжал: "А у меня, Иова патриарха, и у митрополитов, архиепископов, епископов и у всего освященного Собора, которые при преставлении царя Федора Ивановича были, мысль и совет у всех один, что нам, мимо Бориса Федоровича, иного государя никого не искать и не хотеть". После этого, естественно, и все прочие архиереи и вообще духовные лица, прибывшие из других городов в Москву, единогласно воскликнули: "И наш совет и желание то же, и мы единомысленны с тобою, отцом нашим, великим господином Иовом патриархом". А за архиереями волею и неволею то же велегласно и многократно повторяли и все бояре, и все выборные Русской земли. Следующие три дня (18 - 20 февраля) Иов торжественно служил молебны в Успенском соборе, чтобы Бог даровал России царя Бориса Федоровича, и на третий день после молебна отправился с духовенством, боярами и множеством народа в Новодевичий монастырь с прежнею просьбою к царице и брату ее от лица всей Русской земли. Но, получив и теперь отказ, патриарх распорядился, чтобы на следующий день молебны отслужены были не в одном Успенском соборе, но во всех церквах и монастырях столицы и чтобы потом все православные с иконами и крестами шли в Новодевичий монастырь просить милости царицы и Бориса Федоровича, а с архиереями тайно приговорил: если опять царица и Борис Федорович откажут, то отлучить его от церкви, самим же сложить с себя святительский сан и во всех храмах запретить богослужение.

Эта последняя мера, впрочем, оказалась излишнею, потому что Борис при виде крестных ходов и особенно чудотворной Владимирской иконы Богоматери, уступая всеобщим неотступным мольбам, согласился наконец принять царство и чрез несколько дней торжественно въехал в Москву и вступил на престол. Патриарх разослал грамоты по всей России, чтобы по случаю восшествия на престол нового государя везде три дня сряду пелись молебны и происходил колокольный звон, а всем съехавшимся на земский Собор и участвовавшим в избрании Бориса предложил написать и утвердить своими подписями и печатями уложенную грамоту, в которой подробно было изложено, как совершалось это избрание и потом принесена была присяга избранному царю, и в заключение которой присовокупил: "Если же кто не захочет послушать сего соборного уложения и начнет молву чинить в людях, таковый, будет ли он священного сана, или из бояр, или иного какого-либо чина, по правилам св. отец и по соборному уложению нашего смирения да будет низвержен с своего чина и отлучен от Церкви и от причастия Св. Христовых Тайн". Все такие радения о воцарении Бориса Федоровича обошлись патриарху Иову очень недешево. Он сам сознается, что испытал тогда, именно со смерти царя Федора Ивановича до вступления на престол Бориса, "озлобление и клеветы, укоризны, рыдания ж и слезы", конечно, от людей, тайно противодействовавших ему и не желавших видеть царем Годунова.

Едва успел Борис занять царский престол, как пришла весть, что крымский хан Казы-Гирей поднимается на Москву с своею ордою. И Борис, собрав до 500000 войска на берегах Оки, отправился (2 мая) к нему в Серпухов, но потом пришла другая весть, что хан шлет своих послов, которые действительно и прибыли (29 июня) к Борису с просьбою о мире. В продолжение этого времени царь и патриарх писали друг другу послания. Царь извещал о своем походе и просил молитв, патриарх благодарил за известия и уверял, что молится непрестанно со всем освященным Собором. Эти послания, составленные, вероятно, дьяками, весьма скудны содержанием, зато богаты многословием и напыщенностию выражений. Патриарх величал Бориса "богоизбранным, в благочестии всея вселенныя в концех возсиявшим, наипаче же во царех пресветлейшим и высочайшим, православныя веры крепким и непреклонным истинным поборником" и подобное. А Борис бил челом Иову как "твердому столпу православия, архиерею богодухновенному, первопрестольнику всея Великия России и первому патриарху, великому господину и государю своему и отцу". При возвращении Бориса в Москву Иов устроил ему торжественную встречу и сказал речь, в которой, восхваляя труды и подвиги царя, выражался, что он одним вооружением своего воинства устрашил врага и без крови одержал над ним славную победу. А тотчас по окончании речи патриарх со всем освященным Собором и множеством народа повергся пред Борисом на землю, проливая радостные слезы.

Во время венчания Бориса на царство (3 сентября) он и патриарх обменялись речами. Борис, изложив кратко историю своего избрания, просил патриарха благословить, и помазать, и поставить, и венчать его на царство по древнему царскому чину. Патриарх, повторив другими словами ту же историю, отвечал Борису, что вот ныне он благодатию Пресвятого Духа помазуется от Бога, и поставляется, и венчается на Русское государство, и выражал помазуемому царю свои благожелания. Когда спустя два года по воцарении своем Годунов сделался крайне подозрительным и начал принимать всякие доносы и наветы на своих вельмож и бояр и подвергать их страшным преследованиям и когда многие, обращаясь к Иову, говорили ему: "Что отче святый, новотворимое сие видеши, а молчиши?" - тогда он, по свидетельству его биографа, терзался совестию и сердцем, но не мог ничего сделать, так как царь Борис был строптив и не хотел видеть обличника себе. Святейший только "день и нощь со слезами непрестанно в молитвах предстоял в церкви и в келье своей, непрестанно пел молебные пения собором с плачем и великим рыданием, также и народ с плачем молил, дабы престали от всякого зла дела, паче же от доводов и ябедничества, и бе ему непрестанные слезы и плач непостижимый".

Когда настало для Бориса тяжкое время, когда явился Лжедимитрий, патриарх употреблял с своей стороны все меры, чтобы поддержать власть законного государя. Димитрий прежде всего нашел себе покровителей в Польше, и Иов вместе с прочими архиереями писал (1604) к высшей раде Короны Польской и великого княжества Литовского, к арцибискупам, бискупам и всему духовенству, и удостоверял их в своей грамоте, что выдающий себя за царевича Димитрия - обманщик, бывший монах, диакон Григорий Отрепьев, и просил ему не верить; писал также к знаменитому воеводе киевскому князю Константину (Василию) Острожскому, лично знавшему Отрепьева, и во имя православия убеждал князя обличить обманщика и схватить, хотя обе эти грамоты не достигли своей цели. Из Польши самозванец с небольшою ратью вступил в пределы России, против него послано было царское войско; патриарх в это время пел в Москве молебны о даровании победы царю Борису, убеждал народ твердо помнить данную им присягу государю, с клятвою удостоверял всех, что царевич Димитрий углицкий давно скончался и погребен, что под его именем идет теперь на землю Русскую не кто другой, как известный ему вор, расстрига Гришка Отрепьев, рассылал об этом грамоты по всей Москве, писал в полки к боярам, воеводам, дворянам и ко всей рати и, наконец, в генваре 1605 г. разослал и сам непосредственно и чрез епархиальных архиереев грамоты по всей России. В грамотах патриарх извещал, что литовский король Сигизмунд преступил крестное целование и, признав беглого чернеца расстригу Гришку Отрепьева князем Димитрием углицким, отпустил с ним своих воевод и воинов в Русскую землю, желая в ней церкви Божии разорить, костелы латинские и лютеранские поставить, веру христианскую попрать и православных христиан в латинскую и люторскую ересь привести и погубить. Затем, описав довольно подробно похождения Лжедимитрия и сказав, что он сам уже уклонился в ересь и имеет намерение поругаться в России православной вере и устроить костелы латинские и люторские, патриарх давал приказ духовным лицам прочитать эту грамоту по всем церквам, ежедневно петь молебны, чтобы Бог не попустил литовским людям превратить Русскую землю в латинскую ересь и даровал победу царю Борису над самозванцем, и всенародно проклинать не только самого самозванца, изменника, еретика, отметника веры христианской, но и всех воровских его советников и государевых изменников, которые тому вору последуют, как преданы они уже вечному проклятию в Москве всем освященным Собором.