5 декабря 1537 года медицинский факультет Падуанского университета на торжественном собрании присудил ему ученую степень доктора медицины, с высшим отличием. После того как Везалий публично продемонстрировал вскрытие, Сенат Венецианской республики назначил его профессором хирургии с обязательством преподавать анатомию. Он сделался профессором в 23-летнем возрасте. Его яркие лекции привлекали слушателей со всех факультетов. Вскоре под звуки труб, под развевающимися флагами он был провозглашен врачом при дворце епископа Падуанского.
Деятельная натура Везалия не могла мириться с рутиной, царившей на кафедрах анатомии многих университетов, где профессора монотонно читали длинные выдержки из трудов Галена. Вскрытие трупов производились малограмотными служителями, а профессора с объемистым томом Галена в руках стояли рядом и время от времени показывали палочкой на различные органы по мере их упоминания в тексте
В 1538 году Везалий опубликовал анатомические таблицы — 6 листов рисунков, гравированных учеником Тициана художником С. Калькаром. В том же году предпринял переиздание трудов Галена и через год выпустил свои «Письма о кровопускании». Работая над выпуском трудов своих предшественников, Везалий убедился, что они описывали строение человеческого тела на основании секции органов тела животных, передавая ошибочные сведения, узаконенные временем и традицией. Изучая человеческий организм путем вскрытий, Везалий накопил неоспоримые факты, которые решился смело противопоставить канонам прошлого. В течение четырех лет своего нахождения в Падуе Везалий пишет свой бессмертный труд «О строении человеческого тела» (кн. 1–7), который вышел в Базеле в 1543 году и был богато иллюстрирован. В нем приведено описание строения органов и систем, указано на многочисленные ошибки предшественников, в т. ч. Галена. Особо надо подчеркнуть, что после появления трактата Везалия авторитет Галена был поколеблен, а затем низвергнут.
По стечению обстоятельств трактат появился в год смерти Коперника, и тогда же увидела свет книга Коперника «Об обращении небесных тел», произведшая переворот не только в астрономии, но и в мировоззрении людей. К слову, сын купца, каноник Коперник знал толк в анатомии, в свое время он обучался на медицинском факультете Падуанского университета, а по возвращении в Польшу с 1504 по 1512 году занимался врачеванием у своего дяди епископа Ваченроде.
Труд Везалия явился началом современной анатомии; в нем впервые в истории анатомии было дано не умозрительное, а вполне научное описание строения человеческого тела, основанное на экспериментальных исследованиях.
Отец анатомии, Везалий внес огромный вклад в анатомическую терминологию на латинском языке. Взяв за основу наименования, введенные Авлом Корнелием Цельсом (I в. до н. э.), Везалий придал анатомической терминологии единообразие, выбросил, за крайне редкими исключениями, все средневековые варваризмы. Одновременно он свел до минимума грецизмы, что в какой-то мере можно объяснить его неприятием многих положений галеновской медицины. Примечательно, что будучи новатором в анатомии, Везалий полагал, что носителем психического являются «животные духи», которые вырабатываются в желудочках мозга. Этот взгляд напоминал теорию Галена, ибо указанные «духи» были всего лишь переименованной «психической пневмой» древних.
Труд Везалия «О строении человеческого тела» — не только итог изучения предшествующих достижений в анатомии, но и научное открытие, основанное на новых методах исследования, имевших огромное революционизирующее значение в науке того времени. Расточая дипломатично похвалы «божественному мужу» Галену и выражая удивление пред обширностью его ума и разносторонностью знаний, Везалий решается указать лишь на некоторые «неточности» в его учении. Но таких неточностей он насчитывает более 200, и они являются, в сущности, опровержением основных положений учения Галена. Везалий, в частности, первым опроверг ошибочное мнение Галена и других своих предшественников о том, что в сердечной перегородке человека якобы имеются отверстия, через которые кровь переходит из правого желудочка сердца в левый. Он показал, что правый и левый желудочки сердца в постэмбриональный период не сообщаются между собой. Однако из этого открытия, в корне опровергавшего галеновские представления о физиологическом механизме кровообращения, Везалий не сделал правильных выводов, их впоследствии сделал Гарвей.
После выхода в свет великого труда Везалия разразились давно назревавшая буря. Сильвий, учитель Везалия, преклоняясь перед авторитетом Галена, считал ненормальным в человеческом теле все то, что не согласовалось с описанием или взглядом великого римлянина. По этой причине он отвергал открытия своего ученика Везалия. Не скрывая возмущения, он называет Везалия «гордецом, клеветником, чудовищем, нечестивое дыхание которого заражает Европу». Сильвий и его ученики выступили единым фронтом против Везалия, называя его неучем и святотатцем. Однако Сильвий не ограничился оскорблениями, он пишет резкий памфлет «Опровержение клеветы некоего безумца на анатомические работы Гиппократа и Галена, составленные Яковом Сильвием, королевским толкователем по медицинским вопросам в Париже» (1555 г.) Сильвий в 28 главах этого памфлета остроумно высмеивает своего бывшего ученика и друга, называя его не Vesalius, а «Vesanus», что на латинском языке означает «безумный», и, в конце концов, отрекается от него.
Памфлет Сильвия сыграл роковую роль в жизни Везалия. Этот проникнутый злобной и ревнивой завистью документ объединил врагов отца анатомии и создал вокруг его непорочного имени атмосферу общественного презрения среди консервативного лагеря тогдашних ученых медиков. Везалия обвиняли в непочтительном отношении к учениям Гиппократа и Галена, которые были формально канонизированы всемогущей тогда католической церковью, но суждения их и особенно авторитет были приняты как непререкаемые истины Священного писания, и возражать против них было равносильно неприятию последнего. Кроме того, Везалий был учеником Сильвия, пользовался его научными советами, и если Сильвий упрекал Везалия в клевете, то инкриминированное им обвинение казалось правдоподобным. Сильвий не бескорыстно отстаивал авторитет Галена. Его возмущение было связано с тем, что, подрывая авторитет Галена, Везалий уничтожал и его самого, ибо знания Сильвия покоились на тщательно изученных и передаваемых ученикам текстов классиков медицины.
Памфлет Сильвия нанес смертельную рану Везалию, от которой тот уже не оправился. В Падуе возникла оппозиция научным взглядам Везалия. Одним из наиболее активных его противников оказался его ученик и заместитель по кафедре Реальд Коломбо (ок. 1516–1559). После появления инсинуации Сильвия Коломбо резко изменил отношение к своему учителю: стал критиковать, старался дискредитировать перед студентами. В 1544 году, когда Везалий покинул Падую, Коломбо был назначен на кафедру анатомии, но проработал профессором кафедры только год. В 1545 году он переехал в университет Пизы, а затем, в 1551 году, занял кафедру в Риме, где работал до самой смерти. Габриель Фаллопий (1523–1562) сменил на падуанской кафедре Коломбо и объявил себя наследником и учеником Везалия, продолжив с честью его традиции.
Злобные измышления Сильвия привели к тому, что доведенный до отчаяния Везалий прекратил свою исследовательскую работу и сжег часть своих рукописей и материалов, собранных для дальнейших трудов. Везалий вынужденно в 1544 году перешел на поприще врачебной деятельности, на службу к Карлу V. В то время Карл V воевал с Францией, и Везалий в качестве главного военного хирурга должен был отправиться на театр военных действий. Война закончилась в сентябре 1544 года, и Везалий уехал в Брюссель, где вскоре умер его отец. После смерти отца Везалию досталось наследство, и он решил обзавестись семьей. В январе 1545 года в Брюссель прибыл Карл V, и Везалий должен был принять на себя обязанности лечащего врача императора. Карл страдал подагрой и отличался неумеренностью в еде. Везалию приходилось прилагать титанические усилия, чтобы облегчить страдания императора. После отречения Карла V, в 1555 году, Везалий перешел на службу к его сыну, Филиппу II. В 1559 году Филипп II со своим двором переехал из Брюсселя в Мадрид, и Везалий с семьей последовал за ним.