Борис вынужден признаться в том, что появление нового врага толкнуло его на кровавый путь. Семен Годунов, отряженный выяснить, кто скрывается за именем Димитрия, говорит, что и ценою пыток не узнал ничего. Приискивают имя Гришки Отрепьева, беглого чудовского монаха, чтоб как-то переименовать врага. Борис распоряжается умножить шпионов и найти улику на Романовых и, кроме того, в силу продолжающегося голода раздать казну народу, повелев не слушать басен про царевича. Царевич Федор просит отправить его к войскам, царевна Ксения оплакивает перемену в Борисе и его проявившуюся жестокость; Христиан спрашивает, уверен ли Борис в смерти царевича, и пересказывает слухи. Дети уходят, появляется царица, полная язвительности и раздражения на Христиана, толкующего с детьми о «царенке». Царь остается глух к ее требованию отослать Христиана. Семен Годунов сообщает о быстром продвижении изменников, о переходе к ним войск и об упорном сопротивлении Басманова. Василий Шуйский предлагает Борису отправиться самому к войскам или уже послать за вдовствующей царицей, чтоб свидетельствовала о смерти сына. Наказав Шуйскому рвать языки тем, кто распускает слухи, Борис посылает за матерью Димитрия. В доме Федора Никитича Романова бояре Романовы, Сицкий, Репнин и Черкасский пьют за царевича. Приходит Шуйский, сообщает о приказе Бориса, его расспрашивают о произведенном им розыске в Угличе, он отвечает туманно. Семен Годунов со стрельцами, обвинив собравшихся в желании отравой извести государя, берет всех под стражу, нарядив Василия Шуйского вести допрос. Борис, наедине размышлявший над свершившимся предсказаньем («Убит, но жив»), пришедшему Шуйскому велит объявить с Лобного места, что тот сам в Угличе видел труп царевича. На Христиана меж тем наседают советники, толкующие, что он должен отказаться от брака с Ксенией, что Борис выдал себя страхом, что Ксения дочь злодея и слуги. Христиан, чувствуя подступающую дурноту, веря в виновность Бориса, не знает, на что решиться. Приходит Ксения, и он, путаясь в словах и мыслях, говорит о неизбежной разлуке, а потом зовет ее убежать сним от отца-убийцы. Незаметно вошедший Федор вступается за отца, они собираются биться, Ксения, плача, напоминает о данной друг другу клятве. Христиан бредит, и, сочтя его больным, Ксения с Федором уводят его.
На Красной площади сыщики слушают разговоры в народе, идущем с панихиды по царевичу Димитрию (там же провозглашалась анафема Гришке). Провоцируя, толкуя речи в пригодном им ключе, сыщики хватают едва ли не всех подряд. Василий Шуйский с Лобного места ведет двусмысленную речь о наступающем неприятеле и говорит о розыске в Угличе так, что остается неясно, кто же был убиенный младенец. Об эту пору привезенная из монастыря мать царевича, ныне инокиня Марфа, ожидая Бориса и желая ему отомстить, решает признать самозванца сыном; она говорит, что мертвого сына не видала, лишившись чувств, а на панихиде слезы застилали ей глаза. Теперь же, услышав о приметах явившегося царевича, признает, что он чудесно спасся и жив. Царица Мария Григорьевна, желая уличить обман, вводит Волохову. Горе, охватившее Марфу при виде погубительницы сына, выдает ее, но признать смерть Димитрия всенародно она отказывается. Вскоре Борису врач сообщает об ухудшении здоровья Христиана и о своем бессилии. Семен Годунов приносит грамоту от «Димитрия Иоанновича», в коей Бориса более всего угнетает обещанная милость в случае добровольного отказа от престола, а стало быть, уверенность «вора» во всеобщей поддержке. Борис требует привести постриженного Клешнина, дабы увериться в гибели царевича. Его зовут к Христиану, и вскоре он сообщает Ксении и Федору о его смерти.
Двое часовых, несущих ночной караул в престольной палате, в страхе прячутся при появлении бессонного Бориса. Тому мерещится чей-то образ на престоле, и, обнаружив часовых, он посылает их проверить, кто там сидит. Семен Годунов приводит Клешнина, который подтверждает смерть Димитрия, напоминает, что срок Борисова правления, предсказанный волхвами, подходит к концу, зовет его покаяться и удалиться в монастырь. Утром, получив от прибывшего Басманова сведения о частичной победе над «вором», Борис говорит Федору о необходимости венчаться на престол и о присяге, к коей будут приведены бояре. Федор отказывается от престола, ибо не уверен, что «вор» не Димитрий. Борис многозначительно предлагаетпредъявить Федору бесспорные улики смерти царевича, и тот, постигнув отцовское преступление, в ужасе отказывается от доказательств и заявляет, что примет венец. В столовой палате, дожидаясь Басманова и царя, бояре клянут обоих и обмениваются вестями о «царевиче». Входит Басманов, сетуя на неуместное свое отлучение из войск. Появляется Борис с детьми. Борис награждает Басманова. Бояре, отметив грусть Ксении, жалеют ее и размышляют, что с ней делать, «когда на царство тот пожалует». Борис требует клятвы верности Федору и утверждения сей клятвы в соборе, теряет силы и падает. При общем смятении он заявляет, что причиной его смерти не отрава, а скорбь, завещает боярам блюсти клятву, напоминает, что «от зла лишь зло родится», и, объявив Федора царем, отходит.