Приготовление эмульсии кардиолипинового антигена.

Для микрореакций используется специальный кардиолипиновый антиген. Для приготовления его эмульсии к 1 мл кардиолипинового антигена добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида и смесь оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Затем ее центрифугируют при 1000-2000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 3 мл 10 % раство­ра натрия хлорида. Осадок взбалтывают до полного ресуспендирования. Эмульсию антигена хранят в холодильнике при температуре +4 °С в пробирке под корковой пробкой. В холодильнике она сохра­няется в течение 1 нед, а при добавлении 0,01 % раствора мертиолата –до 2 нед. Каждый раз перед постановкой реакции эмульсию антигена проверяют на реактивность на заведомо положительной и отрицательной сыворотках.

Техника постановки реакции с плазмой. Кровь в пробирке при стоянии разделяется на два слоя. Нижний содержит эритроциты, а верхний – плазму. Пастеровской пипеткой отсасывают плазму, ста­раясь не захватить эритроциты. При недостаточном количестве плаз­мы пробирку с кровью следует отцентрифугиоовать в течение 5-10 мин при 1000-2000 об/мин. В лунку пластинки из органического стекла (при отсутствии пластин реакцию можно ставить на пред­метных стеклах) вносят кровь от 1 больного и нумеруют лунку соответственно составленному списку. В каждой лунке к 2-3 каплям плазмы добавляют по 1 капле эмульсии антигена; капли перемеши­вают, и смесь встряхивают в течение 5 мин, затем во все лунки добавляют по 1 капле изотонического раствора натрия хлорида; смесь перемешивают покачиванием и оставляют при комнатной темпера­туре на 5 мин. В плазме, полученной от больного сифилисом, появ­ляются хлопья разной степени интенсивности, расцениваемые как положительный результат (3+, 4+), слабо положительный (2+, 1+). При отсутствии сифилиса иногда может быть слабо выраженный флокулят, поэтому учет результатов следует производить, ориенти­руясь на характер реакции в контролях. Поскольку микрореакция носит отборочный характер, при получении положительных резуль­татов сыворотку крови исследуют в КСР, а при необходимости – в РИБТ и РИФ.

Реакция с липоидным антигеном (VDRL).

Следует напомнить, что уже антиген, первоначально использо­ванный Вассерманом в реакции связывания комплемента, содер­жал, как было показано в дальнейшем, не антиген бледной трепо-немы, алипоидное вещество – кардиолипин. Иммуноглобулины, вступающие в реакцию с липоидным антигеном, впоследствии были названы реагинами. Они являются аутоантителами к веществу митохондриальных мембран.

Одним из лучших стандартных методов, в которых используют­ся липоидные антигены, является рекомендуемая ВОЗ реакция VDRL. Название этой реакции происходит от заглавных букв учреждения, где она была разработана, – Venereal Diseases Research Laboratory в Атланте (штат Джорджия, США). Антиген для реакции VDRL вклю­чает 0,03 % кардиолипина, 0,9 % холестерина и 0,21 % лецитина. Его добавляют к инактивированной сыворотке больного, помещае­мой на предметное стекло, которое затем вращают в течение 4-5 мин при комнатной температуре и сразу регистрируют результат: наличие в сыворотке реагинов вызывает макроскопически види­мую флокуляцию. Реактоспособность сыворотки в реакции VDRL выявляется примерно через 4 нед после заражения сифилисом. Ко­личественную оценку циркулирующих антител получают путем раз­ведения сыворотки перед постановкой реакции в геометрической прогрессии: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Ложноположительные результаты (биологическая неспецифическая реактивность) могут обусловли­ваться аутоантителами при заболеваниях, протекающих с наруше­ниями иммунитета (красная волчанка, ревматизм, болезнь Шегрена, дисгаммаглобулинемия), а также при заболеваниях, связанных с усиленным разрушением клеточных ядер (малярия, пситтакоз, вирусная пневмония, карцинома). Главными достоинствами реак­ции VDRL являются низкая стоимость, легкость постановки, быс­трое получение результатов с довольно высокой чувствительностью и специфичностью, хотя и меньшей, чем в реакции с трепонем-ным антигеном.

Реакции иммунофлюоресценции.

Все большее значение для серологических исследований, особен­но при скрытом сифилисе и для распознавания неспецифических результатов стандартных серологических реакций, приобретают спе­цифические серологические реакции. К ним относятся РИФ и РИБТ.

Принцип РИФ основан на выявлении флюоресцирующих анти­тел, так как меченные флюорохромом антитела не теряют способ­ности соединяться с соответствующим антигеном и тем самым обус­ловливают свечение препаратов в сине-фиолетовых лучах, источни­ком которых является ртутно-кварцевая лампа.

РИФ в серодиагностике сифилиса начала применяться в нашей стране с конца 60-х годов (Беднова В. Н., 1977). Ее отличительной чертой, по сравнению со стандартными серореакциями, является более высокая чувствительность (поэтому она бывает положитель­ной у ряда больных уже в первичном серонегативном периоде сифилиса) при сохранении высокой специфичности. Однако, по мне­нию ряда авторов, РИФ уступает по специфичности РИБТ, хотя по технике постановки она значительно проще.

Реакция ставится в нескольких модификациях: РИФ-10, РИФ-200 и РИФ-абс. Считается, что РИФ-10 более чувствительна, а РИФ-200 и РИФ-абс – более специфичны. Реакция ставится не­прямым методом в 2 фазы. В первой фазе реакции на антиген нано­сится испытуемая сыворотка крови. Если в ней имеются соответ­ствующие антитела, то образуется комплекс антиген – антитело. Для выявления образовавшегося комплекса проводится вторая фаза реакции, при которой его обрабатывают меченной флюорохромом иммунной кроличьей сывороткой (против сывороточных глобулинов человека)

Полученный во второй фазе комплекс антиген – антитело опре­деляется с помощью люминесцентной микроскопии. Если свечения антигена нет, то это указывает на отсутствие в испытуемой сыво­ротке крови соответствующих антигену антител.

Наиболее ценной модификацией реакции иммунофлюоресценции является РИФ-200, основным назначением которой считается не ранняя серодиагностика сифилиса, а распознавание неспецифи­ческих результатов КСР и серодиагностика других форм сифилити­ческой инфекции, в том числе и скрытого сифилиса. При установ­лении излеченности сифилиса решающим является только отрица­тельный результат РИФ-200. Как и всякая другая серологическая реакция, РИФ-200 не обладает абсолютной специфичностью, по­этому вопрос о наличии или отсутствии заболевания должен ре­шаться на основании совокупности клинических, серологических и других данных.

Методика постановки РИФ-200. Кровь берут из вены в чистую и сухую пробирку в объеме 5 мл и обрабатывают как для реакции Вассермана. Инактивируют сыворотку однократно в тече­ние 30 мин при температуре 56°С. Хранят при температуре +4 °С или –20°С. Во время лечения больных пенициллином иногда могут быть получены ложноотрицательные результаты реакции, поэтому в этих условиях РИФ проводить не следует.

Антиген. В качестве антигена используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из 7-суточного орхита кролика. Получение и хранение антигена требует соблюдения условий сте­рильности, так как с одним и тем же антигеном реакция ставится в течение длительного времени. (Антиген может быть получен в ампу­лах из ближайшей лаборатории, где ставят РИФ). Перед каждой постановкой реакции взвесь хорошо перемешивают и исследуют в темном поле зрения для определения ее густоты. Для РИФ необхо­димо иметь 40-60 трепонем в темном поле зрения, и, если взвесь более густая, то ее разводят изотоническим раствором натрия хло­рида, (рН 7,2). Разводить надо только то количество антигена, ко­торое необходимо для постановки реакции.

Антивидовая флюоресцирующая сыворотка. В реакции необходима меченная флюорохромом сыворотка крови живот­ных, иммунизированных сывороточным белком человека. Лиофильно высушенную флюоресцирующую сыворотку растворяют при соблю­дении условий стерильности в дистиллированной воде, в том объе­ме, который указан на этикетке ампул, переливают в стерильную пробирку с корковой или резиновой пробкой и в процессе исполь­зования хранят в холодильнике при температуре –4 °С. В день поста­новки реакции нужное количество сыворотки разводят по титру дистиллированной водой. Титр каждой серии необходимо опреде­лять. Для этого берут 5 сывороток крови больных сифилисом и 5 сывороток здоровых людей, разводят их изотоническим раствором натрия хлорида в 200 раз и ставят реакцию с использованием во второй фазе различных разведении флюоресцирующей сыворотки против сывороточных глобулинов человека той серии, титр которой определяется. Окончательным титром можно считать тот, который проверен на 100 исследуемых сыворотках, из которых не менее 20 должно быть от больных сифилисом.