Для удаления яичка (при 6-8-дневном орхите) кролика привя­зывают к станку, обескровливают сердечной пункцией (некоторые предпочитают обескровливать через сонную артерию). Затем забива­ют кролика воздушной эмболией (введение 15 см3 воздуха в крае­вую вену уха). Яички выводят в мошонку путем поглаживания ла­донью по животу кролика сверху вниз. Поверхность кожи мошон­ки, предварительно немного подстриженной ножницами, смазыва­ют спиртом, поджигают, тут же тушат и опять поджигают. Этим достигаются освобождение кожи от шерсти и одновременно дезин­фекция кожи. После этого мошонку покрывают резиновой стериль­ной салфеткой с разрезом, через который выводят наружу яичко. Оператор фиксирует яичко одной рукой, а другой рукой делает скальпелем небольшой поперечный разрез кожи мошонки. Ножни­цами отрезают яичко от подлежащих тканей и помещают его в стерильную чашку Петри. Такого же рода манипуляцию проделыва­ют и с другим яичком. Далее ножницами удаляют придаток, осво­бождают яичко от жира и разрезают его на 10-15 кусочков. Готовят препарат с каплей изотонического раствора натрия хлорида и опре­деляют под микроскопом в темном поле наличие трепонем и их число. Все кусочки помещают в стерильную колбу объемом 50-75 мл, в которую уже налита среда (сыворотка кролика, разведенная 0,83 % стерильным раствором натрия хлорида, в количестве 10-14 мл на яичко). Колбу ставят в аппарат для встряхивания на 20-30 мин. После этого все содержимое выливают в большую стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин для удаления плотных кусочков тканей. Затем надосадочную жидкость сливают и готовят препараты для микроскопии. Определяют число трепонем в темном поле зрения (окуляр 10, объек­тив 40). Если число трепонем большое, то взвесь следует развести, чтобы было по 10-15 трепонем в поле зрения, так как при большем их числе трудно подсчитывать иммобилизованные трепонемы.

Обычно в центрифужной пробирке над осадком оставляют не­которое количество жидкости и дают возможность немного ей постоять. Жидкостью, содержащей большое число трепонем, заража­ют кроликов для следующей постановки реакции. При каждой по­становке следует одновременно производить и заражение. Заражен­ных кроликов содержат в клетках в проветриваемом помещении при температуре +18…20°С. Пища кроликов должна содержать зна­чительное количество витаминов.

Для сохранения трепонем жизнеспособными предложено боль­шое количество различных сред (Овчинников Н. М., 1961).

Первоначально среда Нельсона была очень сложна. Затем Нельсон значительно упростил ее, но она все еще сложна. A. Bellone и М. Bonelli (1957) в качестве среды для сохранения трепонем применя­ют разведенную изотоническим раствором натрия хлорида сыворот­ку человека (2:1), а К. Meinike и К. Lagel (1959) – сыворотку кролика (2:1 или 1:1). Следует отметить, что трепонемы, взвешен­ные в одном изотоническом растворе натрия хлорида и особенно вместе с сывороткой больного и комплементом в небольшой дозе, выживают, судя по контрольным исследованиям, и без какой-либо среды, однако сроки их выживания значительно короче, подвиж­ность менее активна, и наблюдается значительное количество со­мнительных результатов.

Н.М. Овчинников (1961, 1962) предложил для РИБТ простую среду. Готовят 0,2% раствор пищевого желатина на 0,83 % растворе натрия хлорида. Раствор стерилизуют автоклавированием при тем­пературе 110°С в течение 10 мин, после чего добавляют стрептоми­цина сульфат из расчета 1:10000. Среда для опыта состоит из сыво­ротки кролика, разведенной 1:2 изотоническим раствором натрия хлорида, желатина и раствора человеческого альбумина. Альбумин готовят на изотоническом растворе натрия хлорида, стерилизуют фильтрацией через бактериальный фильтр (пригоден только сухой альбумин, лиофильно высушенный); каждый раз при употребле­нии новой серии следует испытать, параллельно со старой, новую серию. Весь запас ингредиентов хранится в обычном рефрижерато­ре.

На 10 сывороток требуется 1,2 мл 0,2 % раствора желатина, 2,8 мл 5 % раствора альбумина и 1,6 мл взвеси трепонем. Вымывание трепонем обычно производят разведенной кроличьей сывороткой, но можно с самого начала использовать указанную среду сохране­ния. Особенно следует обращать внимание на возможность у кроли­ков спонтанного спирохетоза, при котором могут наблюдаться по­ложительные результаты реакции или спонтанная агглютинация трепонем.

При хранении ингредиентов рН среды может меняться. В случае окисления среды к ней следует добавить 1 % стерильный раствор натрия гидрокарбоната до рН 7,2.

Реакция протекает только при условии избытка комплемента, поэтому применяют различные количества комплемента, что в зна­чительной степени зависит от примененной среды. При пользова­нии одной и той же средой установлено, что чем больше взято комплемента, тем больше находят иммобилизованных трепонем, а чем меньше комплемента, тем больше подвижных трепонем. При употреблении желатиновой среды оптимальное количество компле­мента равно 0,15 мл на каждую пробирку. Комплемент применяется свежий, полученный от морской свинки. Консервированный комп­лемент непригоден.

Техника постановки реакции. Пронумерованные пробирки с сы­воротками расставляют в штативе. В журнале нечетными номерами отмечают все смесители, в которые добавлялся активный компле­мент (опыт), и четными номерами – куда добавлялся инактивированный комплемент (контроль). Комплемент добавляют не для каж­дой сыворотки отдельно, а готовят «коктейль», т. е. предварительно соединяют комплемент с антигеном в нужных соотношениях для всех сывороток. Взвесь трепонем в питательной среде из расчета по 0,3 мл на каждую сыворотку делят на 2 части и добавляют в один флакон активный комплемент, а в другой – инактивированный.

В стерильный смеситель для лейкоцитов набирают сыворотку до метки 1. Конец смесителя стерильной ваткой вытирают от сыворот­ки, оставшейся на стенках. Это необходимо, так как при попадании положительной сыворотки в антиген в последующих сыворотках могут быть получены неверные результаты. Во избежание загрязне­ния при больших постановках разливают антиген параллельно в два флакона. После этого набирают взвесь трепонем с активным комп­лементом до метки 2. В другой смеситель набирают взвесь трепонем с инактивированным комплементом. Оба конца каждого смесителя закрывают резиновым кольцом, как для транспортировки крови, взятой для клинического исследования, и встряхивают для смеши­вания. (При отсутствии таких колец их можно сделать, разрезав полую резиновую трубку диаметром до 1 см вдоль и соединив кон­цы). Кольца до опыта и каждый раз после его проведения следует кипятить. Во избежание возможного влияния некоторых сортов ре­зины места ее соприкосновения со смесителем следует смазывать стерильным вазелиновым маслом. Можно не закрывать концы сме­сителя резиновыми кольцами, а заливать их парафином с темпера­турой плавления выше 50°С (парафин с более низкой температурой плавления непригоден, так как при помещении смесителей в тер­мостат парафин может стечь и герметичность системы будет нару­шена), однако это менее удобно. Благодаря тому, что оба конца смесителя закрыты, прекращается доступ воздуха, взвесь трепонем находится в относительно анаэробных условиях.

Для контроля набирают в те же смесители все взвеси с актив­ным и инактивированным комплементом, а также одну взвесь без комплемента. Ставят также реакцию иммобилизации с сыворотка­ми, заведомо отрицательными и заведомо положительными, остав­шимися от прошлой постановки.

Заполненные и закрытые смесители помещают в специальный штатив или коробку с вырезами. На каждый смеситель надевают нумерованные кольца из картона. Смесители помещают в термостат при температуре 35 °С на 18-20 ч. Для регистрации опыта через 18 ч смесители вынимают из термостата попарно – опыт и контроль.

Подсчет подвижных и неподвижных трепонем. По количеству сме­сителей в штативе расставляют и нумеруют маленькие пробирки (12х60 мм). Содержимое смесителя выливают в соответствующую нумеро­ванную пробирку, перемешивают тем же смесителем с надетой на него пипеткой и наносят каплю взвеси с активным комплементом на левую сторону предметного стекла, а на правую сторону – с инактивированным комплементом той же сыворотки; посредине стекла ставят номер сыворотки. Капли накрывают покровными стеклами 20х20 мм. Капли должны быть небольшими, иначе трепонемы «плы­вут» с током жидкости, и тогда суждение об их подвижности и подсчет затруднительны. Учет результатов реакции начинают с инак-тивированного комплемента. Подсчитывают 25-30 трепонем и отме­чают, какое количество среди них подвижных и какое – неподвиж­ных. Если в контроле содержится меньше 17 подвижных трепонем из 25 сосчитанных, то такой опыт непригоден и его следует повторить. В пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвиж­ности трепонем объясняется не иммобилизацией, а токсичностью сыворотки или недостаточно высоким качеством среды сохранения (зафязнение бактериями, примесь медикаментов и т. д.).