Это обстоятельство важно потому, что яйца кролика пригодны для: оплодотворения лишь в течение короткого срока по выходе из яичника. В это время они одеты тонкой белковой оболочкой, которая быстро утолщается по мере продвижения яйца вниз по фаллопиевой трубе; и уже через 18 часов после коитуса яйцо становится недоступным для оплодотворения. Для получения годных к оплодотворению яиц самка покрывается вазэктомированным самцом, который, — не эякулируя в самку семени, провоцирует овуляцию. Овуляция наступает примерно через. 10 часов после коитуса, когда и производится операция, В это время яйца находятся уже в трубе. Труба осторожно вырезается, и яйца вымываются из нее раствором Паннета-Комптона или Рингера тонкой пипеткой, вводимой либо с маточного либо с фимбриального конца в зависимости от ожидаемого по времени местоположения яиц. Капли вытекающего раствора принимаются на стерилизованные слюдинки и просматриваются под микроскопом для отыскания яиц.

Когда яйцо найдено, к промывной капле прибавляются капля спермы, капля куриной или кроличьей плазмы и эмбриональный экстракт. Когда прибавленная плазма образует сгусток, фиксирующий яйцо, культура заделывается по методу висячей капли и сохраняется в термостате при 37°. Все манипуляции, начиная с промывания труб, проводятся стерильно в стерильной комнате (боксе).

Через 40–50 минут после прибавления спермы сперматозоиды проникают в яйцо. Яйца млекопитающих входят в трубу с выделившимся первым направительным тельцем. Второе деление созревания наступает естественно лишь в результате оплодотворения. В культурах in vitro это второе деление созревания наступает через 1–2 часа после прибавления спермы. Часов через 8 наступает первое дробление. Удавалось довести in vitro до третьего деления дробления, до стадии 8 бластомеров, на что требуется до 46 часов, — значительно больше, чем при развитии in situ, при котором стадия 8 бластомеров достигается уже через 24 часа.

Для интересующих нас целей — дальнейшей имплантации зиготы в трубу — достаточно убедиться лишь в наступлении гетерогенного оплодотворения, т. е. продержать яйцо in vitro лишь 1–2 часа. Дальнейшее культивирование может понадобиться лишь для того, чтобы вообще можно, было убедиться в удаче гетерогенного оплодотворения, и для цитологической проверки. Опытами Пинкуса было установлено, что в нынешних условиях культуры in vitro неоплодотворенные яйца с некоторым запозданием, но все же начинают обнаруживать признаки как бы партеногенетического дробления. Хотя деление ядра при этом еще не доказано, но по внешнему виду, принимаемому яйцом, его оказывается почти невозможно отличить от нормально дробящегося яйца. Правда, в большинстве случаев, но не всегда, образующиеся шары дробления оказываются при таком «партеногенезе» неодинаковой величины. Так как не вполне равномерное дробление происходит и при нормальном развитии яиц кролика и тем большей неравномерности возможно ожидать при гетерогенном оплодотворении, — то наступление оплодотворения для каждой гибридной комбинации должно быть проверено на окрашенных и нарезанных препаратах.

Для оплодотворения in vitro, особенно для длительных опытов, сперма должна быть получена стерильно из эпидидимиса или из vas defferens в стерильный капиляр.

Гибридизация млекопитающих in vitro в настоящее время произведена Ямане и Диомидовой и Кузнецовой (1933, неопубл.) и Красовской (1934, неопубл.). Ямане оплодотворял яйца кролика спермой крысы и даже лошади. В обоих опытах получено в надлежащем виде выделение второго полярных телец, что Ямане и считает доказательством произошедшего оплодотворения.

Целью его работы была однако не сама гибридизация, но выяснение того, является ли стимул, вызывающий второе деление созревания, специфическим, видовым, или он может быть привнесен и сперматозоидом другого вида млекопитающего. Цитологического исследования судьбы проникшего сперматозоида и участия его ядра в дальнейшем дроблении Ямане произведено не был».

Диомидова и Кузнецова оплодотворяли яйца кролика спермой морской свинки (другой подотряд грызунов) и наблюдали несколько раз правильное дробление, в отдельных случаях до 8 бластомеров. Цитологического подтверждения наступившего оплодотворения произведено еще тоже не было, но правильность и своевременность стадий дробления делают вероятным, что гетерогенное оплодотворение действительно имело место. Наконец в только что законченных опытах Красовской цитологически показано, что при оплодотворении яиц кролика спермой крысы (другой подотряд!) в 75 % происходит настоящее дробление и образующиеся бластомеры имеют ядра. Происходит также выделение и второго направительного тельца. При оплодотворении спермой морской свинки картина оказывается уже существенно иной, — отшнуровываются лишь участки дейтоплазмы, без участия ядра, и не достаточно еще ясно-, происходит ли действительное оплодотворение. Наконец сперматозоиды собаки повидимому вовсе не проникают в яйцо кролика.

Оплодотворение in vitro является делом очень кропотливым, требующим большой тщательности и большого материала. Тем по менее тот свет, который эти работы проливают, на проблему гетерогенного оплодотворения млекопитающих, с лихвой окупает затраченный труд. Если, как и можно было ожидать (см. выше стр. 134), даже столь гетерогенное оплодотворение, как кролик × крыса (разные подотряды), протекает легко, то проблема помощи ему оказывается снятой и все внимание гибридизатора при работе с млекопитающими придется сосредоточить на проблеме осеменения, в общем гораздо более легкой и перспективной. Необходимо произвести подобные же исследования с другими видами млекопитающих и с птицами.

После того как гетерогенное оплодотворение достигнуто и преодолены стоящие на этом пути препятствия, гибридизатор встречается с новыми препятствиями — в виде неспособное и гибридного эмбриона к нормальному развитию в той или иной степени; в той или иной форме. Наша работа упирается в явление нежизнеспособности гибридов, при настоящем уровне наук ставящее наиболее трудно преодолимые препятствия. Однако, как увидим ниже, и здесь возможно, по крайней мере в некоторых случаях, вполне плодотворно ставить вопрос о преодолении нежизнеспособности гибридов, что естественно делает необходимым анализ степеней и форм нежизнеспособности и выяснение их причин. В этом анализе мы должны прежде всего различить две проблемы: первая, более общая, связана с жизнеспособностью или нежизнеспособностью первого поколения (F₁) гибридов, возникающей непосредственно. в результате гетерогенного оплодотворения; вторая связана с такими явлениями, когда, с одной стороны, от вполне жизнеспособных гибридов F₁ получается в той или иной степени нежизнеспособное дальнейшее потомство, или, наоборот, от мало жизнеспособного F₁ в следующих поколениях возникает потомство, более жизнеспособное. Обе эти стороны вопроса очевидно имеют для гибридизации и ее практического использования самое серьезное значение.

Как увидим ниже, ряд авторов связывает общим объяснением как. явление нежизнеспособности гибридов, так и явление повышенной: их жизнеспособности, — так называемый гетерозис. Если однако некоторые стороны теории гетерозиса и нежизнеспособности имеют родство, то во всяком случае рассматривать оба вопроса отдельно вполне возможно. И тем более — возможно, что в работе гибридизатора явление нежизнеспособности гибридов играет роль препятствия, которое нужно преодолевать, тогда как гетерозис является чрезвычайно ценным свойством, вопрос о преодолении которого может ставиться, лишь в исключительных случаях, когда он действительно переходит-в свою противоположность, например осложняя роды слишком — сильным развитием плода:

Формы и степени нежизнеспособности гибридов чрезвычайно разнообразны. Гибрид может, быть вполне жизнеспособным, а в случае наличия гетерозиса даже более жизнеспособным, чем чистые виды. В других случаях гибрид может оказаться с более или менее ослабленной жизнеспособностью, которая восстанавливается до нормы лишь при специальном подборе внешних условии (см. ниже случай гибридов дрозофил). Далее мы встречаемся с так называемым явлением сублетальности, при котором, как у некоторых гибридов бабочек, развитие идет вполне нормально, а затем на стадии куколки останавливается. В еще более тяжелых случаях гибрид гибнет еще раньше благодаря дисгармоничному, или прямо тератологическому развитию, как например в отдаленных скрещиваниях рыб. Эго отмирание может опускаться к еще более ранним стадиям, и наконец гибрид может погибать уже при самом начале дробления.