Однако в это время Юстиниан, подозревавший, что Велизарию свойственны определенные политические амбиции, отозвал его — отчасти и из-за того, что вторжение нового и энергичного царя Персии Хосрова (Хусру) I угрожало крупными проблемами на востоке. В 540 г. Хосров I вторгся в пределы империи и захватил Антиохию, один из богатейших и важнейших городов Сирии; поскольку незадолго перед вторжением остготы отправили посольство в Персию, возможно, что это вторжение стало результатом сговора между готами и персами, стремившимися использовать занятость имперских войск на западе, в то время как готы пытались исправить ситуацию в выгодном направлении для себя. И при отсутствии Велизария готы под руководством нового короля Тотилы за короткое время сумели вернуть себе Равенну, Рим и большую часть Италии. Ромеям потребовалось еще десять лет мелких кампаний по всей Италии, чтобы окончательно сломить сопротивление остготов, но к этому времени завоеванная страна была настолько истощена, что едва могла содержать новоявленную имперскую бюрократию.
Амбициозные планы Юстиниана простирались очень далеко. Но на деле ко всему достигнутому ему удалось добавить только восстановление имперской власти в южной Испании, отвоеванной у вестготов, также ариан. Стремясь возродить былое величие Рима, император велел произвести кодификацию римского права, в результате чего появились «Дигесты» и «Кодекс Юстиниана», которые впоследствии предоставили основу для развития византийского законодательства. Стремясь играть роль правителя империи и защитника никейского вероучения (православия) и церкви, Юстиниан подавил последние очаги язычества в империи, а также провел ряд административных реформ и преобразований с целью модернизации государственного управления. Однако его стремление вмешиваться в церковные дела привело Юстиниана к конфликту с папской властью в отношении, например, так называемых «трех сочинений». В 543 г. император издал указ против написанных в IV–V вв. «трех сочинений» (авторами которых были Феодор Мопсуэстский, Феодор Кирхский и Ибат Эдесский, обвиненные монофизитами в несторианстве). Целью эдикта было умиротворение монофизитов. Документ должен был быть поддержан папой римским Вигилием. Тот и вправду — не сразу — поддержал эдикт, но это решение встретило сопротивление в Западной церкви, и в 553 г. Константинопольский собор осудил «три сочинения». Папа был арестован императорской гвардией и вынужден был подтвердить свое согласие. Однако новая попытка компромисса не удалась из-за отказа монофизитов принять «ново-халкедонскую» позицию.
Юстиниан отнюдь не всегда был популярен в империи. В 532 г. он едва не потерял престол во время крупного восстания в Константинополе, получившего название «Ника»; было организовано против него и несколько заговоров, разоблачавшихся до того, как их участники успевали перейти к делу. Историк Прокопий, сопровождавший Велизария в его походах и составлявший летопись правления, написал полную злобных нападок «Тайную историю», в которой осуждал буквально каждое действие Юстиниана. Книга Прокопия свидетельствует о враждебности, которую вызывала политика императора у различных лиц — в частности Велизария.
После своей кончины (565 г.) Юстиниан оставил империю, значительно расширившую свою территорию, но слишком растянутую как в военном, так и в экономическом отношении. Юстиниан видел в себе воплощение высшей римской власти; преемники Юстиниана столкнулись с новыми врагами, отсутствием наличных денег, постоянным недовольством населения высокими налогами и с потребностью в солдатах, со всеми расходами на их содержание. Племянник и наследник Юстиниана Юстин II начал с того, что перестал выплачивать ежегодный «взнос» Персии (фактически — крупную сумму, предназначенную для того, чтобы войска ее не нападали на империю; персидский царь квалифицировал это как дань), что послужило причиной очередной дорогостоящей войны на востоке. В 568 г. теснимые кочевниками-аварами (тюркским кочевым народом, подобно гуннам за два века до того находившимся в процессе становления собственной степной империи) германцы-лангобарды, оставив свое отечество, бежали с западного Дуная и Дравы в Италию. На севере Италии лангобарды легко прорвали оборону византийцев и создали в центральной части полуострова и на юге его ряд самостоятельных княжеств. Авары же захватили прежние земли лангобардов и превратились в основного противника Византийской империи на Балканах.
В период между серединой 570-х гг. и до конца правления императора Маврикия (582–602) империя смогла восстановить неустойчивое равновесие на востоке. Несмотря на несколько военных поражений, ромеям удалось также укрепить северную границу на Дунае, но спорные области в Италии и на Балканах были опустошены войной и не могли служить для снабжения армии. Маврикий умело использовал разразившуюся в Персии в 590–591 гг. гражданскую войну и помог свергнутому молодому царю Хосрову II победить соперников. Когда внутренний конфликт в стране завершился, между двумя империями был заключен новый договор, согласно которому Византия, — учитывая помощь, оказанную Хосрову, — получила назад некоторые земли и несколько крепостей, потерянных во время предыдущих войн.
Однако Маврикий был непопулярен в армии из-за неудачных войн на Балканах, а также в связи с его попытками взять под контроль финансовые средства, выделяемые на ведение военных действий. Последнее обстоятельство — справедливо или нет — расценивалось солдатами как скряжничество и жадность. Дело кончилось тем, что в 602 г. в войсках на Дунае вспыхнул мятеж, солдаты взяли Константинополь и посадили на трон своего ставленника центуриона Фоку. Вся семья Маврикия была вырезана, началась тирания Фоки (602–610). Хотя как правитель он производит впечатление некомпетентного политика, однако войска его удерживали позиции и на Балканах, и на востоке, в Персии, войска которой вторглись в пределы Византии под предлогом мести за Маврикия. Фока был популярен во многих регионах империи, но все-таки не во всех, и в 610 г. Ираклий, экзарх (военный губернатор) Африки, правивший в Карфагене, повел в поход флот, чтобы низложить Фоку. Одновременно с той же целью его двоюродный брат Никита отправился с сухопутным войском через Египет в Малую Азию. Фоку удалось низложить без особого сопротивления, и Ираклий был провозглашен императором. Часть войск осталась верной Фоке, так что за его низложением последовала непродолжительная гражданская война в Египте и Малой Азии. Однако в этот период империя не могла действенно обороняться от внешних врагов, и через несколько лет авары и славяне заняли большую часть Балкан, а персы в 614–618 гг. захватили Сирию и Египет и, поставив там своих наместников, продолжили наступление в Малой Азии. Италия, теперь разъединенная на изолированные друг от друга лангобардскими княжествами округа, была предоставлена собственной судьбе, что способствовало развитию автономии и ощущению самодостаточности. Это привело к фактическому отделению данного региона, лишь номинально остававшегося частью империи.
В 626 г. персы и авары, совместно осадившие Константинополь, потерпели поражение (современники связывали эту победу с покровительством Богоматери). Ираклий еще в 623 г. смело вторгся в Персию через территорию Армении, перенеся войну на коренные персидские земли. Проведя ряд блестящих военных кампаний, он разгромил армию Хосрова и заставил персидских полководцев просить мира. Сам Хосров был низложен и убит. Было восстановлено довоенное положение дел, и Византийская империя укрепилась. Однако, хотя граница номинально проходила по Дунаю, Балканы по-прежнему фактически не принадлежали Византии, за исключением мест нахождения ее войска, в то время как финансовое положение империи было катастрофически подорвано войнами.