Если хищные грибы, улавливающие нематод, обнаружены, то их следует по возможности выделить в чистую культуру. При наличии спор этих грибов выделение произвести легко, сняв споры с вершины воздушного конидиеносца при помощи стерильной иглы с очень небольшой частицей стерильного агара на конце и перенеся их в чашку с кукурузным агаром. Лучше всего эту операцию производить под бинокулярным микроскопом. Выбрав конидиеносец с удобным расположением спор, нужно поднять объектив микроскопа примерно на 1 см, навести фокус на конец иглы и, сохраняя ее в поле зрения, опускать объектив до тех пор, пока цель не появится в поле зрения. Подобный способ дает возможность осторожно подвести иглу к споре и избежать опасности случайного прикосновения к поверхности агара. Любая попытка подвести иглу к спорам, сохраняя последние в фокусе, неизбежно оканчивается неудачей.

Грибы, улавливающие нематод, обычно хорошо растут в чистой культуре на агаре, сваренном на кукурузном отваре, но они, как правило, не образуют ловушек до тех пор, пока не появятся нематоды. Чтобы вызвать образование ловушек, лучше внести небольшое количество гриба в культуру нематод, чем добавлять нематод в чистую культуру гриба.

Может случиться, что культура начнет катастрофически высыхать прежде, чем полностью закончится исследование найденных в ней интересных грибов. В таких случаях ее можно омолодить, налив слой свежего агара сверху старого; агар предварительно следует охладить примерно до температуры его затвердевания, как это делается при постановке почвенных культур. Агар для этой цели следует применять или чистый, или приготовленный на слабом настое кроличьих экскрементов, так как если вновь добавляемая среда будет богата питательными веществами, то начнется чрезмерно сильное развитие плесневых грибов.

При предварительном исследовании культур с чашки Петри снимают крышку и внимательно осматривают поверхность агара при помощи 16-миллиметрового объектива. Бинокулярная лупа не пригодна для этой цели, так как при обнаружении интересного экземпляра последний нужно сейчас же исследовать при помощи более сильного объектива. Я установил, что для предварительного просмотра наиболее удобен 9-миллиметровый объектив; поле зрения его достаточно велико и позволяет быстро просмотреть всю поверхность культуры, а в случае необходимости более подробного исследования можно путем замены окуляра, дающего шестикратное увеличение (Х 6), окуляром X 15 обеспечить требуемое увеличение изображения. На этой стадии исследования следует искать мертвых нематод, особенно если они встречаются группами, гифы, несущие ясно заметные ловушки, и споры хищных грибов.

Более детальное исследование интересующего нас материала можно производить in situ (на месте), поместив каплю воды на поверхность агара и закрыв ее покровным стеклом или, что еще лучше, используя сильный объектив с водной иммерсией. Однако при этом способе трудно обеспечить правильное освещение исследуемого объекта, так что для детальных наблюдений следует приготовить специальный препарат[36]. Проверочные исследования хищных грибов следует всегда производить на живом неокрашенном материале, если только не требуется изучить различные явления в клеточных ядрах, так как ввиду нежного строения грибов они мало пригодны для изготовления постоянных препаратов.

Для подготовки свежего материала к исследованию нужно вырезать участок агара из культуры и лезвием бритвы срезать с него поверхность, несущую интересующий нас гриб. Полученный тонкий срез агара можно затем поместить в воду, используя для этого предметное стекло с углублением (для висячей капли). Этот способ дает возможность вести дальнейшие исследования в наилучших условиях. Неудобство этого метода заключается в толщине предметного стекла, которая обычно не допускает использования апланатического конденсора с большой апертурой для получения наибольшей резкости изображения: избежать этого неудобства сможет тот, кому удастся достать очень тонкое предметное стекло, какие иногда появлялись в продаже еще до войны. У меня имеется одно такое стекло, общая толщина которого меньше 1 мм; оно вполне пригодно для работы с апланатическим масляно-иммерсионным конденсором с численной апертурой 1, 4, и я храню его еще тщательнее, чем самый микроскоп!

Иногда толщина нематод может вызвать затруднения, так как 2-миллиметровый иммерсионный объектив может коснуться покровного стекла при фокусировании стороны животного, удаленной от наблюдателя. Трехмиллиметровый иммерсионный апохромат разрешает эту проблему, так как численная апертура этого объектива такая же, как у 2-миллиметрового, но сочетается со значительно более длинным фокусным расстоянием.

Чтобы собрать требуемые сведения о хищных грибах, необходимо изготовлять постоянные микроскопические препараты, хотя при этом надо еще раз со всей строгостью подчеркнуть, что всюду и везде, где это возможно, исследования нужно проводить на живом материале. Вполне удовлетворительные препараты можно приготовлять, пользуясь классическим лактофенольным методом. Объект помещают на предметное стекло в каплю лактофенола с анилиновой синей (cotton blue) и подогревают до тех пор, пока от жидкости не пойдет пар, после чего закрывают его покровным стеклом. Если обмазать края покровного стекла красным лаком для ногтей, то такой препарат можно с полным основанием считать постоянным. Описанный метод вполне пригоден для окраски и монтажа спор хищных грибов, равно как и для внутренних паразитов нематод, но для хищников типа Arthrobotrys и близких к нему форм он мало пригоден.

Для более нежных хищных грибов рекомендуется эритрозино-глицериновый способ. Кусочек агара с находящимся на нем экземпляром гриба вырезают из культуры и фиксируют в растворе формалина с уксусной кислотой следующего состава:

Фиксация должна продолжаться по крайней мере 24 часа, но материал можно без всякого вреда для него оставлять в этом фиксаторе на целые годы. В течение следующих 24 час. материал промывают несколько раз в воде. Поверхность куска агара с находящимся на ней грибом срезают бритвой и помещают в насыщенный водный раствор эритрозина не меньше чем на 30 мин.; перекрасить препарат невозможно, поэтому лучше оставлять его в краске на всю ночь. После краски материал 2—3 раза промывают в воде и переносят в каплю 10%-ного глицерина на часовое стекло, которое оставляют незакрытым, чтобы концентрация жидкости достигла уровня вязкости чистого глицерина. Процесс достижения первоначального объема длится около двух дней. Остатки воды извлекаются из препарата уже в эксикаторе, после чего экземпляр при возможно более низкой температуре монтируют в капле расплавленного глицеринового желе. При помощи описанного метода можно получать прекрасные препараты эндозойных хищных грибов; он вполне пригоден и для большинства свободноживущих хищных грибов. Образцы Dactylella ellipsospora, показанные на рис. 17 и 18, смонтированы вышеуказанным способом.

Постоянные препараты хищных грибов в канадском бальзаме приготовить нелегко, потому что и споры и приспособления для ловли нематод имеют тенденцию сильно сжиматься в процессе обезвоживания. При условии очень медленного обезвоживания можно получить вполне удачные препараты в «Евпарале» (Euparal). Кусочки агара фиксируют в формалине с уксусной кислотой, отмывают и, как и в предыдущем случае, срезают бритвой тонкий слой агара с грибом. Затем срезы агара слегка окрашивают гематоксилином Делафилда; допускать чрезмерно сильного окрашивания не стоит, так как дифференциация подкисленным спиртом редко бывает успешной. После окраски материал «подсинивают» парами аммиака и очень медленно обезвоживают, применяя постепенно повышающиеся концентрации спирта; когда обезвоживание заканчивается перенесением в абсолютный спирт, материал можно промыть в «экстракте Евпарала» и монтировать в «Евпарал» на предметных стеклах, лучше с углублениями, ввиду толщины срезов агара.